病理制片技术的规范和质量控制（摘）
病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生做出正确的病理诊断。因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片的控制，为提高临床病理诊断水平，促进临床病理学事业的发展做出我们应有的贡献。 一、 高素质技术人员的规范管理
- 要有敬业精神，强烈的工作责任心、 2 努力学习，刻苦钻研，掌握过硬的基本功，引进和学习新技术，工作精益求精。
- 领导重视，为技术人员提供进修学习和提高的机会。
- 技术员和医生，技术员与技术员互相团结，密切配合，发挥团队精神的作用、 二、 仪器设备分规范管理
- 配备先进，高质量的仪器设备是保证和提高制片质量的重要条件、
- 正确使用，定期维修保养，保证仪器设备在最佳的状态下工作、 三、 标本和资料档案的规范管理
- 标本和送检单的接收 检查标本和送检单的名字是否相符，有否标本，有没有病史。标本补充固定液，送检单编号登记。
- 资料档案的规范管理 诊断报告发出后，附有诊断报告记录的送检单、玻片和组织蜡块存档并专人保管。建立严格的资料借出制度，确保档案资料不被丢失。 四、 技术操作规范
- 及时固定组织：应采用 10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用浓甲醛液 1 份加蒸馏水 9 份稀释）固定组织，因甲醛易氧化成甲酸，因此多会偏酸性，最理想的是配成中性甲醛液。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约 4 小时左右，然后取材时修切成大小约 22 x 22mm，厚不超过 2mm 的组织块进行脱水。 取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。
l 常规固定液的配制 （1） 10%甲醛液 浓甲醛 10ml 蒸馏水 90ml (2 ) 缓冲中性甲醛液 浓甲醛 10ml PBS 缓冲液（Ph7.2） 90ml (3 ) 10%中性甲醛液 浓甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 碳酸钙 加至饱和
•冷冻切片固定液 (1) 乙醚酒精液 无水乙醚 1 份 95%酒精 1 份 (2) 酒精?冰醋酸液 95%酒精 100ml 冰醋酸 3~5 滴
•细胞学涂片固定液的配制 (1) 酒精?冰醋酸液 95%酒精 97ml 冰醋酸 3ml (2) 乙醚--酒精液 95%酒精 50ml 乙醚 50ml 冰醋酸 1ml (3) Carney`s 液 无水酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml
- 脱水彻底：脱水液常用乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般 70%~100%的浓度），逐步置换组织内的水份。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇的时间可适当延长，高浓度乙醇脱水时间不能过长。
- 透明充分: 透明液多采用二甲苯，组织脱水后转入二甲苯，依据组织的大小、厚薄，约置 30~90 分钟。
- 浸蜡足够: 浸蜡多用纯净而熔点稍低(56~58 度)的石蜡，浸蜡时采用三级或四级，以尽量清除二甲苯。浸蜡时间依据组织大小厚薄而定，一般为 1~2 少时。浸蜡时包埋机所设定的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态。这样，组织才能取得良好的浸蜡效果。如浸蜡温度过高，导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。
- 包埋恰当:包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高(约 3~5 度)，否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋是时把组织最大最平切面或所需是病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。 组织包埋完后，要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。
- 切片要薄:切片首要任务是把切片刀研磨锋利，这是能否切薄而平整切片的关键。其次要把刀架上的切片清除角调至 2~5 度，在此角范围内，才能切出良好蜡片。如使用一次性刀片，可转动刀座上的弧形刻度盘选取最合适的刻度(该合适刻度并不等于真正的切片清除角)。切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧或包埋少组织蜡块过硬时就会出现跳片，使蜡片成一截厚一截薄。切片的厚度应为 3~4μm，对一些组织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为 2~3μm 。 7。贴片烤片：切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开，并根据所用包埋石蜡的温度调节水温在 42~46 度左右。为了利于展平蜡片，可先把蜡片放在一缸缸约 10~15%乙醇内，然后用玻片再将蜡片移至恒温贴片盆，由于水的表面张力比乙醇大，蜡片由乙醇移至水后就很容易展平。贴片时再注意“定点”和“定向”。最后即可置入约 60~65 度的烤片箱内烤 15~30 分钟，也可放在热板上烘干，蜡片就可牢固地粘附在载玻片或盖玻片上。
- 切片在染色前必须脱蜡干净：未完全脱蜡的组织切片，染色后组织和细胞模糊不清。脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为 10~20 分钟，应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些，不应过短。
- 苏木素染液一定要配好:苏木素液配制的好坏，决定染色的优劣。苏木素配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木素液煮沸。要配制自然成熟的苏木素则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木素染液的染色时间为 5~20 分钟，自然氧化成熟的苏木素液染色时间可以更长。
苏木素染液的配制 (1) Harry`s 苏木素 苏木素 1g 无水酒精 10ml 硫酸铝钾 20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5g 冰醋酸 8ml 分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即冷却，恢复至室温后过滤备用。 (2) 改良 Lillie-Mayer`s 苏木素 苏木素 2.5g 无水酒精 20ml 硫酸铝钾 5g 蒸馏水 330ml 碘酸钠 250mg 甘油 150ml 冰醋酸 10ml 分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。 (3) Mayer`s 苏木素 苏木素 100mg 蒸馏水 100ml 碘酸钠 20mg 硫酸铝铵 5g 柠檬酸 100ml 水合氯醛 5g 用蒸馏水溶解苏木素后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵和水合氯醛，过滤后备用。 10. 掌握好盐酸酒精的分化：这是一个重要环节。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木素染色的深浅来决定，一般是 1~2 秒，若切片不分化或分化不足，组织着色过深使核浆的景界不清楚；若分化过度，胞核过淡不清晰 。用 Mayer`s 苏木素染色，通常都不分化。盐酸酒精分化后，切片留有酸液，易使切片褪色。另一方面苏木素经流水冲洗来促兰。流水冲洗一般需 15~30 分钟。如要说短时间，可用碱性的促蓝液代替流水冲洗。
盐酸--酒精分化液的配制 浓盐酸 1 ml 70%酒精 99ml
促蓝液的配制 （1） Scott 促蓝液 重碳酸钠 0.35g 硫酸镁 2g 蒸馏水 100ml 麝香草酚少量 (2 ) 氢氧化氨水溶液 浓氨水 0.1~1ml 蒸馏水 99ml (4) 碳酸锂水溶液 碳酸锂 1g 蒸馏水 100ml 11. 曙红染色要适宜: 曙红是作为对比染色，染色时不应染的太红，也不能染得太淡，否则红兰对比不鲜明。每 200ml 曙红水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用，如加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢失效。曙红水溶液易发霉，每缸曙红液加入甲醛液 1~2 滴有防霉作用。
曙红液的配制 （1）0. 25~0.5%曙红 Y 水溶液 曙红 Y 0.25~0.5g 蒸馏水 100ml 冰醋酸 1 滴 (2)0.5 曙红 Y?氯化钙水溶液 曙红 Y 0.5g 蒸馏水 100ml 无水氯化钙 0.5g (3)0.25~0.5%曙红 Y 酒精溶液 曙红 Y 0.25~0.5g 80%酒精 100ml １２．切片脱水透明要彻底：ＨＥ染色后，要彻底脱水透明，才能进行树胶封盖，成为永久标本。如果脱水透明不彻底，封片后呈白色雾状，镜下模糊不清，过一段时间染片就褪色。脱水要经过多次无水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯进行脱水。如采用后者，染片要经过多次二甲苯以除去石炭酸。
石炭酸?二甲苯混合液的配制 石炭酸(加热到约 60 度) 1 份 二甲苯 3 份
- 封胶要求中性，浓度适宜: 酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。国产树胶偏酸，易使切片褪色。树胶过浓，封片时容易导致气泡，树胶过稀，封片时使胶外溢，影响美观。
- 在整个染色过程中不让切片干涸: 切片完全干涸，会使组织收缩、割裂，形成所谓”龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核。 完成染色后，每张片子要在显微镜下观察，检查制片过程中有没有发生差错。不好的片子不交给医生。
HE 切片的质量要求 一张高质量的 HE 切片要做到:
- 切片完整、贴片恰当
- 切片较薄而均匀
- 无皱折
- 无刀痕
- 染色清晰、核浆分明、透明度好
- 无固缩、龟裂、污染
- 封胶适当、玻片清洁
- 字体端正、号码清楚
五、组织化学技术操作规范 组织化学技术制片与一般的制片基本相同，但在操作上有其特殊的要求。 （一） 组织化学技术对组织细胞前处理的要求
- 组织切片方法 根据所检测物质的性质及所采用的染色方法，组织切片分为冷冻切片和石蜡切片(培养的细胞也可分为细胞涂片、细胞冷冻切片和细胞石蜡切片)。在冷冻切片中，组织细胞的各种成份丢失最少，但形态结构差，可溶性物质弥散；石蜡切片中组织细胞的许多特殊物质减少甚至丢失，酶活性降低甚至失去活性，但形态结构好，所需显示的物质定位清晰。
- 组织的固定 无论用于冷冻切片的组织，取材越新鲜越好，以保持生物体的原状，使细胞内的化学成份尽可能保存下来。组织取材后应立即进行冷冻切片，切片可于-20 度或-80 度保存。若作石蜡切片，组织取材后即进行固定，因所检测的物质不同选用不同的固定液及固定时间。最常用的固定方法是用固定液浸泡组织。固定液有多种，不同的固定液具有不同的作用，至今还没有一种固定液能用于所有染色的组织固定，最常用、用途最广的是甲醛液。欲保存固定肝糖原则不能用甲醛固定液，需要用酒精固定液，如，Gender 或 Cranky 氏固定液。在组织 固定过程中，不能溶解细胞内的化学物质，使所显示的物质不会出现移位现象，定位准确。如用酒精性固定液固定肝糖原，会将糖原颗粒推向细胞的一边，称为“极化现象”，属于一种人为改变，对定位有影响，在观察时应注意。 （二） 组织化学染色方法的基本要求
- 组织化学染色方法要有较高的特异性，能特异地显示所需要观察的物质组织化学染色与常规 HE 染色不同，每种组化反应都需要某种特殊的染料、试剂或底物，需要一定的染色时间和 PH 环境，使该反应对所显示的物质具有一定的专属性。如显示糖原需用 Schiff 无色品红试剂；显示铁离子应用亚铁氰化钾和盐酸；显示碱性磷酸酶需用 β-甘油磷酸钠作底物，PH9.4 的环境下进行反应。在染色的操作过程中，应采用已知含有或不含有所显示的物质的标本进行阳性和阴性对照，以证实该方法的特异性和操作的准确性。如显示碱性磷酸酶，可用正常的肾组织进行对照，肾皮质碱性磷酸酶应为阳性为髓质应为阴性。也可用抑制剂和消除法进行阴性对照。如在孵育液中加入 0.01mol/L 的氟化钠可抑制酸性磷酸酶的活性，染色结果则为阴性，在糖原染色前，用淀粉酶消化对照的组织切片，则对照片糖原染色为阴性。
- 组织化学染色方法要具有一定敏感性，方法越是敏感，越能检测组织细胞中含量少的物质。
- 组织化学染色在组织或细胞内所产生的反应产物必须具有一定的颜色，该颜色越鲜艳、越深越好。显示一种物质可有不同的染色方法，阳性反应有不同的颜色，选用的方法应使阳性物颜色鲜艳，深色，而复染的底色要浅淡，这样对比才清晰，易于观察及照相。
- 组织化学染色最后显示出来的物质要具有稳定性，尽可能不被制片过程中所用的化学试剂所影响。在染色过程中，避免使用减弱、破坏或溶解阳性物的试剂。如，着染苏丹的脂肪要用水溶性胶封片，不能经二甲苯透明和中性树胶封片。 组织化学技术的某些方法还存在着不能完善的地方，如要保持较好的组织细胞形态结构，使被检测的物质定位准确，则需要用石蜡切片染色，但组织在制作石蜡切片的固定、脱水和包埋过程中，被检测的物质会受到破坏甚至消失。如在石蜡切片中，肾组织的酸性磷酸酶活性仅保留 20%；心肌的琥珀酸脱氢酶则全部失去活性。在肝糖原染色中用 10%甲醛液固定肝组织可使肝糖原完全溶解消失，改用酒精性固定液可保存肝糖原，但由于固定液渗透作用，使肝糖原颗粒出现移位“极化现象”。用冷冻切片可保存大量的酶，糖原丢失极少，又不会出现“极化现象”，但组织形态结构及阳性物质定位较差。此外，冷冻切片容易出现冰晶，破坏原有的组织结构，影响观察。有些存在于组织细胞中的化学物质较为复杂，往往需要用多种染色方法来进行鉴别，如用 AB（PH2.5）法可显示一般的粘液；要区分中性和酸性粘液需要用 AB-PAS 染色法；酸性粘液中要区分硫酸粘液和唾液酸粘液要用 HID-AB 染色法。 六、免疫组织化学技术操作规范 （一） 组织切片的要求 免疫组织化学技术适用于冷冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冷冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片也适用于冷冻切片。冷冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定脱水包埋过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。 （二） 组织的固定 组织经过固定可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散，常用的固定液为 10%甲醛液，最好选用 10%中性甲醛液，国定时间为 4~6 小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。 （三） 载玻片的处理 组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用较好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制备：
- 载玻片经酸洗冲洗干净后烤干； 2．2%APES 水溶液浸 1~2min；
- 蒸馏水浸洗 1~2min； 4 烤干备用。 APES(3-MINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA 产品 (四)组织切片前处理 经甲醛液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理(也称抗原修复)常用的主要有以下方法:
- 胰蛋白酶消化 将切片置入胰蛋白酶消化液 (0.2%胰蛋白酶 0.1%氯化钙水溶液 PH7.8 ) 消化 30 分钟，37℃。
- 微波加热 将切片置入 0.01mol/L pH6.0 的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率加热 10 分钟，自然冷却。
- 高压锅加热法 用高压锅加热 0.01mol/L pH6.0 的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时 90 秒钟至 2 分钟，自然冷却。 是否进行切片前处理要按第一抗原说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。 (五)内源性过氧化物酶的消除 组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶消除，方法是用 3%过氧化氢作用 15 分钟。 (六)酶标抗体系统中的酶与显色剂 在 LSAB 等常用免疫组化方法中，与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(AP 或 AKP), 显色剂有 DAB、AEC、固红和固蓝等。在 HRP 系统用 DAB 和 AEC 等作显色剂，DAB 显色阳性物呈棕色，AEC 呈红色；AP 系统用固红和固蓝作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝呈蓝色。DAB 显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，用其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。 (七)实验对照 为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
- 阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者应设阳性对照。
- 阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
(八)抗体的保存和稀释 抗体应于低温保存，第一抗体可分成少包装于-20 度保存，使用时存放在 4 度，不宜反复存放于 4 度和-20 度之间。检测试剂盒一般存放于 4 度，不宜于-20 度保存，如长时间不用可存放于-20 度，解冻使用后则不能再存放于 0 度以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。 浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至 1:5~20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用 0.01mol/L PBS Ph7. 4，在 PBS 中加入 1%BSA 和 1%正常稀释后的稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
（九）染色结果的观察
- 阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜，如 LCA 和 UCHL1 等；（2）细胞质，如 Keratin 和 Lysozyme 等；（3）细胞核，如 PCNA 和 ER 等。
- 组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性表达，但绝大多数都是非特异性染色。
- 染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
- 组织切片背景深与下列因素有关： （1）第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。 （2）显色剂 DAB 浓度过高或 H2O2 太多。 （3）正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了 PBS 洗。 （4）抗体纯度不高、 （5）抗体孵育切片后洗不干净。
（十）免疫组织化学染色后的复染背景 免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有劳色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是 DAB 显色呈棕色?Mayer`s 苏木素复染细胞核呈蓝色。
（十一）染色操作注意事项
- 第一抗体分为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠和抗兔抗体，不能连接错，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好比选用即是抗鼠又是抗兔的抗体。
- 抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过 37 度、如果不是由于诊断急于发报告，一般一抗置于 4 度孵育过夜较佳。
- 用于一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
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