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固定

固定是组织处理最重要的一步，也是在整个制片过程中最无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽可能接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织、细胞自溶与腐败，防止细胞内酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，具有硬化作用，增加了组织的韧性，有利于取材和组织脱水。如果标本没有及时固定或固定不恰当，组织已经自溶或腐败，将无法逆转。

固定的注意事项：

  1. 固定必须及时：组织离体后，必须立即固定（在 1 小时内）。
  2. 固定液的选择：固定液的选择非常重要，应该根据制作要求选择合适的固定液。最常用的固定液是 4%甲醛液或 4%中性缓冲甲醛液。
  3. 固定液的量：必须大于组织体积的 4-10 倍。
  4. 固定液的浓度：浓度必须准确，过稀或过浓都会影响组织的形态和固定的效果。
  5. 固定液的质量：发现固定液变质，如甲醛液体产生白色沉淀，应立即更换。
  6. 固定的温度：室温或放于 35-37℃ 的全封闭组织处理机内，温度过高，会加快组织的自溶和组织的过度收缩，并破坏细胞内的抗原和 DNA。
  7. 固定的时间：新鲜标本，应该剖开固定 12-24 小时后再取材。大标本取材后在室温下还需再固定 4-6 小时，小标本取材后应该在室温下再固定 3-4 小时，如果是新鲜小标本取材，必须再固定 4-8 小时。如果室内温度低，固定时间还需延长。固定时间不超过 48 小时。
  8. 需要做分子病理的标本，从标本离体至组织脱水开始，总固定时间一般不要超过 24 小时（厚度 2mm），同时决不要少于 6 小时。

（一）最常用的固定液：

  1. 4%甲醛液（10% 福尔马林液）：甲醛（HCHO）是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为 40%，易挥发，日久会自行分解，产生白色沉淀(副醛：多聚甲醛或三聚甲醛)，并有甲酸产生，影响组织的固定和细胞核的染色。长期保存应该加入碳酸镁、碳酸钙等碳酸盐中和。我们用作病理标本固定的为 4％甲醛水溶液（9 份水加 1 份浓甲醛液，实际含甲醛 4％，俗称 10% 福尔马林液）。甲醛是通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用，组织穿透性好，组织收缩小，HE 染色对比鲜明 ，能完好地保存组织的形态。但交联和共价键的形成改变了蛋白的三维结构并覆盖了抗原的决定簇，降低了组织的抗原性，因此，现在国际上都提倡使用 10%中性缓冲福尔马林液。 优点：① 渗透能力较强，固定均匀。② 收缩小。③ 能保存脂肪和类脂体（冰冻切片法）。④ 增加组织韧性。⑤ 有利于嗜银染色。⑥ 可固定高尔基体和线粒体。 缺点：① 不能沉淀核蛋白的白蛋白。② 溶解组织内尿酸盐结晶。③ 经甲醛固定的陈旧组织较容易产生色素沉淀。（可用碱性乙醇去除：浓氨水 1ml 加入 75%乙醇 200ml 内，切片脱蜡后浸入上述液体 30 分钟；或者 1%氢氧化钾 1ml 加入 80%乙醇 100ml 内，切片脱蜡后浸入上述液体 10 分钟。如还没有去除干净，可以再延长，处理完成后流水冲洗 5 分钟，常规染色）。
  2. 4%中性缓冲甲醛液（10%中性缓冲福尔马林液）：能完好地保存组织的形态，并使蛋白质、核酸等大分子在细胞内原位凝固沉淀，防止这些物质的崩解和弥漫流失，对大多数抗原和肿瘤基因等保存较好，是免疫组织化学和分子病理最常用的固定液，固定时间 24-36 小时为宜。 4%中性缓冲甲醛固定液配方：甲醛 100ml，蒸馏水 900ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）6.5g，用 1N NaOH 调整 pH 至 7.0。（由于国内甲醛质量不稳定，取甲醛 120ml，蒸馏水 880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4• H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g，效果更好）。 作者观点：
  3. 10%福尔马林液是最常用的病理标本固定液，由于免疫组化和分子病理的开展，我们提倡使用 10%中性缓冲福尔马林液，以便更好地保存抗原及肿瘤基因。我们对很多组织分别使用 10％中性缓冲福尔马林液和 10%福尔马林液固定后进行免疫组化结果对照，虽然发现大多数抗原保存差异并不是很明显，但是，对少数组织的抗原和 FISH 癌基因检测（如 Her-2）等影响较为明显。因此应该使用 10％中性缓冲福尔马林液，如果星期六、星期日休息的单位，应该在固定时间结束后，把组织长时间停留在 75%乙醇、95%酒精中。
  4. 由于 HE 染色核的等电点 pH 为 3.3-3.6，经 10%中性缓冲福尔马林液固定后，在一定程度上改变了细胞核的 pH 值，影响细胞核与苏木精染料的结合，导致细胞核容易发灰，特别是固定不充分的情况下。
  5. 固定不佳的组织，由于脱水剂（乙醇）能使蛋白质发生凝固，使脱水剂难以渗入到组织中去，造成组织脱水不佳；同时乙醇又起到凝固性固定的作用，使交联与凝固性固定在不同程度上混合，对抗原的保存起到了不良的影响（如 AAF 固定液）。因此，固定是组织处理过程中最重要的一步：固定充分的组织，由于固定液已经全部渗透到组织中去并与组织结合，细胞质、组织结构都已经固定，脱水剂很容易将组织中的固定液和水分置换出来，因此固定好的组织很容易脱水；同时固定不足对抗原的影响远远超过了固定过度所造成的影响。
  6. 固定时间、固定液浓度与渗透速度：手术切除器官及肿瘤标本的固定和取材后标本的固定不尽相同，手术切除标本，由于具有一定的立体外形、包膜等，固定液浓度过高，往往会过引起周围组织收缩，影响固定液浸透到组织深处，造成组织中央固定不佳；固定液浓度过低，容易造成组织边缘水肿而组织中央固定不佳的现象。当手术标本过大时，如脾、肾、全胃、肠等脏器，由于渗透速度的因素：10% 福尔马林液固定液，24 小时只能穿透 2-3mm 的实体组织和 5mm 的多孔疏松组织（渗透的速度受标本的致密度、包膜的厚度、包膜外有无脂肪包裹、固定液的量、温度等因素影响；而取材后的组织，上下二面组织被刀切过，固定液容易渗透），如标本的厚度超过 5mm，经 24 小时固定后，通常只有靠近边缘 1-2mm 左右的组织固定好，而中央的组织固定不佳，甚至腐烂。因此此类标本应该切开固定，剖开标本厚度以 3-5mm 为佳，当标本超过厚度后，甲醛与组织的结合速度会变慢。 第二天取材后的标本，脱水前还应该固定 6-8 小时。 在一定范围内，固定液浓度高，所需固定时间短（但固定浓度过高，组织容易发硬，细胞收缩明显）；而固定液浓度低，所需固定的时间长（过低的固定液浓度，会导致组织水肿，还容易引起组织变质）。因此合适的固定液浓度，不仅能快速的固定组织，还能保存其优良的细胞形态、结构和抗原。      5. 固定速度与温度的关系：固定液温度（加温或室温）越高，固定速度越快，所需的时间就越短，同时细胞收缩也越明显，抗原丢失也越多，过高的温度还会加速组织的腐烂（当标本体积大，组织中间固定液还未渗透到的部分由于温度升高，细胞开始变质）；反之，温度低，固定速度就慢，过慢的固定速度同样也会使固定液未渗透到的组织发生变性。因此选择合适的厚度和固定温度非常重要，大体标本应该剖开后在室温下固定，取材后标本可选择室温 18℃-25℃ 固定。当室温开始下降后，应该逐渐延长固定时间，最好能在 37-45℃ 恒温箱（或在全自动恒温密封式脱水机）内固定。

（二）其它固定液：

  1. 乙醇 CH3CH2OH：易燃、易挥发的无色透明液体，还原剂，可以被氧化成为乙醛，不能与铬酸、重铬酸钾等氧化剂配成固定液。优点：① 乙醇有固定，硬化和脱水的作用。② 保存糖原可用 100%乙醇固定。③ 在保存浆、膜抗原上比 10%中性福马林更好。缺点：① 渗透力较弱，容易造成表面发硬，固定液较难渗透到组织深部。② 能沉淀核蛋白，但沉淀物溶于水，导致核的着色不良。③ 可溶解血红蛋白和损害多种色素。④ 固定速度较慢。⑤ 对某些抗原有损伤。⑥ 对核抗原保存不利。⑦ 能引起组织、细胞的收缩。 95%乙醇常用于细胞涂片固定，组织标本固定一般不采用，只有在没有福尔马林的情况下，才能临时使用，等送到有福尔马林的科室后应立即更换。目前很多环保固定液均为醇性固定液。                              图 1-12 95%乙醇固定的组织,组织表面硬化
  2. 乙酸 CH3COOH ：又称醋酸，由于该液体在气温 16.6℃ 以下时，会结成冰状固体，所以又称冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白，使未分裂细胞核的染色质沉淀成块状，可以清楚地显示细胞核的结构。乙酸渗透性强，固定快，可以使组织膨胀，因此最好与其它液体配合使用。如甲醛乙酸液：10ml 甲醛，5ml 乙酸，85ml 水，对于 HE 切片固定效果好，细胞结构清晰，染色对比鲜明。但乙酸不能沉淀白蛋白，也不能固定脂肪、糖和类脂。
  3. 苦味酸（ 2,4,6-三硝基苯酚）：黄色晶体，密度 1.767，凝固点 122.5℃，爆炸点 300℃，常制成饱和溶液贮藏。能沉淀蛋白质，具有软化组织的作用，同时还具脱钙的作用。一般与其它液体配合使用，如 Bouin 液：饱和苦味酸水溶液 75ml，甲醛 20ml，乙酸 5ml。Bouin 液是骨髓、睾丸等组织固定的良好固定液，适用于结缔组织染色，尤其是三色染色时更为理想。由于固定液偏酸，pH 为 1.7 左右，对抗原有一定的损害，不适宜于标本的长期保存，固定时间 12-24 小时。经苦味酸或 Bouin 液固定后的组织必须流水冲洗 4 小时以上。
  4. B-5 固定液（乙酸钠-升汞-甲醛固定液）：渗透力较强，多用于固定淋巴组织。固定液配方：无水乙酸钠 1.25g，升汞 6g，甲醛 10ml（用时加入），蒸馏水 90ml。如果在此配方中不加甲醛，即为 B-4 固定液。凡使用 B-5 等用具有汞成分固定的组织，在染色前，都必须先用 0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脱汞处理。
  5. 重铬酸钾 K2Cr2O7   ：橙红色板状结晶，与可燃物接触可能着火。比重 2.676，熔点 398℃，有毒性。常用 1%-3%水溶液作固定，穿透力极强，组织收缩小；可使蛋白质变为不溶性，不能使蛋白质沉淀（但在溶液中加入乙酸后，也能使蛋白质沉淀）；对线粒体、高尔基氏体的固定效果较好。重铬酸钾固定液的缺点是可使染色质溶解。经重铬酸钾固定的组织必须流水冲洗 12 小时以上。
  6. 戊二醛 C5H8O2： 带有刺激性气味的无色透明油状液体。戊二醛对糖蛋白、糖原、微管、内质网和细胞基质等都有较好的固定作用，穿透力比四氧化锇强，能保存某些酶的活力，长时间的固定也不会使组织变脆。但不能保存脂肪，对细胞膜的显示也较差，也无电子染色作用，所以戊二醛（2.5%水溶液）只能作电镜组织处理的前固定，固定时间需 2 小时以上。
  7. 锇酸 OsO4 ：白色或淡黄色晶体，剧毒，强氧化剂，在使用时要注意对眼睛、呼吸器官、皮肤的保护。锇酸对蛋白质、脂肪、脂蛋白固定良好。有较强的电子染色作用，组织样本图象反差好，所以锇酸（1%水溶液）常作电镜组织处理的后固定。固定时间视环境温度而有所不同，室温高于 18℃-20℃ 时 1 小时，低于 18℃-20℃ 时 1.5?2.0 小时（属作者个人经验）。缺点是固定时间过长容易造成组织发脆，不容易切片。需在临用前几天配制以确保其充分溶解。
  8. Carnoy 液：对于染色体固定较好，能很好地显示 DNA 和 RNA，固定速度快，一般 3mm 厚的组织块固定 1 小时左右，较厚组织最好也不要超过 4 小时。 固定液配方：乙酸 10ml，氯仿 30ml，无水乙醇 60ml。
  9. Helly 液：也称 Zenker 福尔马林液。对细胞质的固定较好，特别是细胞质内的特殊颗粒、胰岛以及心肌闰盘保存都有良好的效果。因其含有汞成分，故在染色前，应先用 0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脱汞处理。 固定液配方：重铬酸钾 2.5g，升汞 5g，蒸馏水 100ml，甲醛 5ml。
  10. Kanovsky 液：对细胞抗原、微细结构的保存较单纯使用戊二醛效果要好，常用于免疫电镜标本的前固定，一般采用先灌注、再浸泡的固定方法。固定时间 10-30 分钟，然后用缓冲液漂洗。最后用蔗糖液浸泡，恒温冷冻切片。 固定液配方：25%戊二醛 10ml，40%甲醛 5ml，0.2mol/L 二甲胂酸钠缓冲液 49ml，无水氯化钙 50mg，蒸馏水 33.5ml（最后加入），pH7.3。
  11. Rossman 液：常用于糖原的固定。组织固定 12-24 小时后，用 95%乙醇洗，无水乙醇脱水。 固定液配方：无水乙醇苦味酸饱和液 90ml，甲醛 10ml。
  12. Zenker 液：对免疫球蛋白、病毒包涵体（如 Negri 小体）的固定效果较好，细胞核和细胞质染色比较清晰，常用于三色、磷钨酸-苏木精等特殊染色的固定。对于含血量较多的标本不适合。固定时间 12-36 小时，加热可加快固定作用。 固定液配方：储存液由重铬酸钾 2.5g，升汞 5g，蒸馏水 100ml 组成，用时再加入乙酸 5ml。配法：将重铬酸钾和升汞加入蒸馏水，加温至 40-50℃ 溶解，冷却后过滤，保存于棕色玻璃磨砂瓶内。此液不能用金属容器盛放，组织固定后，也不能用金属镊子夹取，如果此配方中的乙酸用甲醛代替即为 Helly 液。 用 Zenker 液固定后的组织必须流水冲洗 12 小时去除重铬酸钾（也可用亚硫酸钠溶液或 1%的氨水溶液洗涤），在脱水前要先用 0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脱汞处理。
  13. 4%多聚甲醛液：常用于免疫组织化学组织的固定。 固定液配方：4g 多聚甲醛，溶于 100ml 蒸馏水，加温至 60℃，搅拌溶解。多聚甲醛不容易溶解，也可将液体放于密封瓶中，60℃ 温箱过夜溶解。

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