脱钙液

所谓脱钙，就是用化学或物理的方法把组织内的磷酸钙和碳酸钙去除。
      脱钙的方法很多，硝酸脱钙速度很快，但细胞核不容易上色，对抗原也影响较大。EDTA、电解等方法染色效果较好，对抗原保存好，但脱钙时间较长。配方有很多，很难说那个好，那个不好，主要要根据你处理的组织类型、要求以及允许你完成脱钙的时间，在什么时间完成脱钙。10%硝酸，脱钙能力很强，速度很快，如果在刚脱完后就立即中止，效果也很好。但由于脱钙速度快，不容易控制时间，日常工作中不可能过几分钟就去看一下，所以容易脱钙过度，导致细胞核无法上色。

**脱钙的原则：
**1. 要能切片。2. 染色对比要鲜明，最起码细胞核能染上色。3. 尽可能保存抗原。4. 时间要快，但要容易控制。

脱钙的关键：

1. 不能脱过了。
2. 脱钙后流水冲洗要充分。

因此，选择一种合适的脱钙液及处理方法，非常重要。现介绍几种适合日常工作常用配方如下：

1. 骨髓组织：

可用 Bouin 液（饱和苦味酸水溶液 75ml+甲醛 20ml+乙酸 5ml）固定 24 ～ 48 小时，然后用 10%盐酸甲醛液（10ml 盐酸+10ml 甲醛+80ml 水）脱钙 0.5 ～ 1 小时，流水冲洗 1 ～ 2 小时，放入常规流程固定脱水。如果用 4%甲醛固定，然后再脱钙，会造成细胞收缩（核变小、胞浆空洞化）、核染色质不清晰。但用 Bouin 液固定，会导致少量抗原的丢失（如 Ki-67）。

2. 钙化、疏松骨组织：

可用甲酸盐酸液（5ml 甲酸+ 7g 氯化铝+ 8.5ml 盐酸+10ml 甲醛，加水至 100ml）或 10%盐酸甲醛液脱钙 6 ～ 24 小时，流水冲洗 3 ～ 4 小时，放入常规流程固定脱水。较硬的角质层、瘢痕等组织也可用 10%盐酸甲醛液（或 10%乙酸）软化。

3. 致密骨组织：

锯成薄片，用 30%盐酸甲醛液（30ml 盐酸 + 10ml 甲醛 + 60ml 水）脱钙数小时至数日，用针检查脱钙效果，容易刺穿后中止，流水冲洗 3 ～ 4 小时，放入常规流程固定脱水。

4. 切片过程中发现蜡块有钙化或脱钙不彻底：
       可将蜡块直接脱钙将蜡块组织面修出后直接放入 10%或 30%盐酸甲醛液 1 ～ 3 小时（也可用 10%硝酸 30 ～ 60 分钟），流水冲洗 5 ～ 10 分钟，然后直接切片。注意只要脱到能切几张就可以了，不要过度，否则钙质完全脱去后会造成组织软化直至无法切片。

其他脱钙液：

1. 硝酸-间苯三酚液：
   浓硝酸 10ml，间苯三酚 1g，通风橱内混合。混合时会产生浓的棕黄色双硫磷烟雾。然后加 10%硝酸 100ml。骨组织块 5mm 厚脱钙时间 12-24 小时。
   优点：该液脱钙速度非常快，大概是所有脱钙液中速度最快的一种脱钙液。
   缺点：
   （1）细胞核染色很差。
   （2）如果脱钙时间太长对组织有较大的损害。
   （3）要用 5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少 24 小时。
   （4）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

2. 硝酸水溶液：浓硝酸 5-10ml，蒸馏水加至 100ml。厚度 5mm 骨组织块脱钙 12-24 小时。
   优点：
   （1）硝酸水溶液是一种迅速的脱钙液。
   （2）对组织损害较少，细胞核着色比福尔马林-硝酸液要好。
   （3）组织可直接通过 70%乙醇去除酸。
   缺点：脱钙时间必需仔细控制防止过度脱钙损害组织。

3. 福尔马林-硝酸液：40%甲醛 5ml，浓硝酸 10ml，蒸馏水 85ml。5mm 厚的骨组织块脱钙时间需要 1-3 天。
   优点：
   （1）福尔马林-硝酸液是一种迅速的脱钙液。
   （2）该液脱钙的组织比间苯三酚-硝酸液细胞核染色好。
   （3）可作为紧急活检脱钙用。
   （4）该液和 5-10%硝酸水溶液一样对组织几乎没有损害。
   缺点：
   （1）该液对细胞核作用较慢，使细胞核着色较差。
   （2）要用 5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少 12 小时。

4. Perenyi’s 液：
   10%硝酸 4 份，0.5%铬酸 3 份，无水乙醇 3 份。5mm 厚的骨组织块脱钙时间需要 2-7 天。
   优点：
   （1）该液是一种温和的脱钙液，可能由于铬酸和乙醇的存在可以抑制组织泡软。
   （2）细胞核和细胞浆细微结构着色均好。
   （3）推荐该液作为常规脱钙使用。
   （4）组织脱钙后不需要碱性液中和和流水冲洗。脱钙组织直接移到 90%乙醇中。
   缺点：
   （1）脱钙较慢，因此，紧急情况下不能使用。
   （2）用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

5. Von Ebener’s 液：
   饱和水溶液氯化钠 50ml，蒸馏水 50 ml，浓盐酸 8 ml。
   厚度 5mm 骨组织块脱钙 3-7 天。
   优点：
   （1）细胞核染色相当好。
   （2）不需要水洗，脱水时酸就会首先被脱出来。
   缺点：使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。

6. 甲酸液：
   甲酸 10ml，10%福尔马林盐 90ml。
   厚度 5mm 骨组织块脱钙时间需要 3-7 天。
   优点：
   （1）脱钙同时可以对组织固定。
   （2）对细胞核染色比较好。
   （3）推荐用于小块组织和牙齿脱钙。
   缺点：
   （1）脱钙比较慢，不推荐作为常规标本脱钙使用。
   （2）不推荐作为密皮质骨脱钙使用。
   （3）要用 5%硫酸钠液中和，然后充分流水冲洗至少 18 小时。

7. 三氯醋酸液：
   三氯醋酸 5g，10%福尔马林盐 95ml。厚度 5mm 骨组织块脱钙时间需要 5-8 天。
   优点：
   （1）对细胞核染色好。
   （2）脱钙之后不需要水洗，酸乙醇可以去除。
   缺点：
   （1）脱钙作用慢，仅仅推荐用作骨的细针脱钙。
   （2）不推荐作为密皮质骨脱钙使用。

8. Flemming’s 液：
   1%铬酸 15ml，2%四氧化锇 4ml，冰醋酸 1ml。
          Flemming’s 液虽然是一种固定液可作为微细骨针脱钙用。液体需要新鲜配制，并在容器底部会形成沉淀。脱钙后如果直接通过乙醇可以形成不能溶解的色素。脱钙之后标本必需充分流水冲洗去除过多的铬盐。使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。用苏木精染色时细胞核受抑制。

9. AFIP 甲酸-柠檬酸钠液：
   A 液：甲酸 25ml，蒸馏水 25ml。B 液：枸橼酸钠（结晶）10g，蒸馏水 50ml。
   临用时 A 液和 B 液等量混合，每日换 1 次，因为柠檬酸钠可以和钙离子螯合，具有促进脱钙的作用。

10. 蒋维中（Jangweizhong’s）液：
    盐酸 80ml。甲酸 70ml，三氯化钙 50g，冰醋酸 25ml 甲醛 100ml，生理盐水 900ml。
    此液脱钙迅速，0.5cm 厚的松质骨 6-20 小时就可以完成脱钙。对组织影响极小，染色效果好。配制简便，脱钙后不需要用碱性液中和。

11. 螯合脱钙剂脱钙法
    EDTA 是一种良好的脱钙液螯合剂，它对组织破坏极小，不产生气泡，不影响染色，如果加温至 37℃，可以加快脱钙速度。
    EDTA 脱钙液：
    乙二胺四乙酸（EDTA）5.5g，10%中性福尔马林 100ml。
    厚度 5mm 骨组织块脱钙时间需要 7-21 天。
    优点：
    （1）经 EDTA 脱钙的组织染色结果好。
    （2）对组织的结构损害小。
    （3）用化学方法测试可以确定脱钙的终点。
    缺点：
    （1）脱钙速度相当慢，不适合常规标本脱钙使用。
    （2）脱钙后组织会稍微变硬。