FISH 和 PRINS 技术

一、荧光原位杂交（FISH）   是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。 FISH 技术是利用特异的 DNA 探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检测细胞进行 DNA-DNA 原位杂交，并用荧光法显示。 （FISH）实验步骤 试剂配制： （1）变性液(70％甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml 蒸馏水；28ml 甲酰胺。每次新鲜配制。      （2）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水 16ml；甲酰胺 20ml。每次新鲜配制。调节 pH 前升至室温。

1. 用硅化玻片，石蜡切片，60℃ 烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精，斜置切片，空气中干燥。 2. 蛋白酶处理:      1）每个染色缸 40ml 蛋白酶 K 消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml 倒人 Facal 管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。      2） 37℃ 水浴槽中预热染色缸和蛋白酶 K 溶液。37℃ 孵育 20min。      3） 2×SSC 在室温下漂洗切片 3 次，每次 1min。      4）梯度酒精脱水（-20℃ 预冷），空气中干燥。 3. 变性：      1）每一个立式染色缸配制 40ml 变性溶液；      2）78℃ 水浴槽中平衡预热混合液染色缸；      3）78℃ 孵育 8min；      4） 即移入-20℃ 预冷 70%酒精的染色缸内 2min，再依次移入 80%、90%和 100%的-20℃ 预冷酒精内，每缸 2min；      5）空气干燥。 4. 杂交： 1）准备探针；      2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；      3）滴 10μl 探针在切片的组织上，加盖玻片；      4）盖上湿盒盖，37℃ 孵育 12h ～ 16h。      杂交后水洗：      5）镊子小心去除盖玻片；      6）43℃ 预热杂交后水洗溶液 40ml 水洗切片 15min；      7）2×SSC(37℃)洗两次，每次 10min；      8）切片放人染色缸的 1×PBS 内待检测，勿使切片干燥。      检测：      9）从 1×PBS 中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理 4 张切片。      10）每张切片使用 30μl ～ 60μl 罗丹明抗-地高辛抗体或 FITC 卵白素，室温下孵育 20min；      11）去掉塑料盖膜，把切片放入含 1×PBS 的染色缸。1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min。 扩增：      12）从 1×PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出；      13）每张切片滴 30μl ～ 60μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min；      14）去掉塑料盖膜，把切片放人含 1×PBS 的染色缸。1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min；      15）从 1×PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出；      16）每张切片滴 30μl ～ 60μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min；      17）1×PBS 室温下洗 3 次，每次 2min。     5. 细胞核染色：      1）张切片加 10μl ～ 20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育 2 ～ 5ml；      2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃ 冰箱。切片在染色之后 1h 内可以在显微镜下观察。

二、用引物介导的原位标记（PRINS） 是 PCR 和荧光原位杂交（FISH）的结合， PRINS 是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶 DNA 互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP 或半抗原-dUTP）和 dATP、dCTP、dGTP 的延伸，依赖标记，新合成的 DNA 就能直接的或间接的带有 FITC，用荧光显微镜观察。 PRINS 实验步骤     1. 常规脱蜡浸入 0.01mol/LPBS；     2. 用 0.2mol/L 盐酸处理 5min；     3. 蛋白酶 K(25μg/m1)消化 37℃ 15min；     4. 分别用 80％，95％和 100％酒精脱水，室温干片；     5. 加 PCR 混合液 25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加 200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物 250ng，Taq DNA 聚合酶 2U)，加盖片；     6. 94℃ 变性 5min 后置入 65℃ 湿盒中 5min；     7. 用 0.1×SSC 液，65℃ 洗 5min；     8. 片于 65℃ 10s ～ 20s；用 4×SSC-0.1％吐温 20 液 42℃ 洗 5min，2 次；     9. 经 Buffer I 液洗后滴加 20％羊血清封闭 30min；     10. 加地高辛抗体复合物(1:500)室温下 2h；     11. BufferⅢ 液洗 5min；     12. 用 BCIP-NBT 显色 1h ～ 2h，在镜下控制，终止显色；     13. 用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。