分子诊断实验方法
生物大分子主要指核酸(DNA 和 RNA)和蛋白质，通过从分子水平上完成 DNA, RNA 或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。 （1）基因诊断 基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。 人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组 DNA，应用恰当的 DNA 分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现 DNA 的多态现象以及遗传病的异质性。基因诊断检测的目标分子是 DNA 或 RNA，反映基因的结构和功能。检测的基因有内源性(即机体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌等)两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。 基因诊断的意义在于不仅能对某些疾病做出确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。 基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。 1. 核酸分子杂交技术 1）原理： 具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定 DNA 或 RNA 序列进行定性或定量检测。 2）基因探针及其标记： 基因探针是一段与待测 DNA 或 RNA 互补的核苷酸序列，可以是 DNA 或 RNA，长度不一，可为完整基因，也可为其中一部分。根据探针的来源和性质分为基因组 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针。作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链(或通过变性形成单链)，二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。在与 DNA 样本杂交过程中，借助上述标记物可探察出特异性或差异性 DNA。双链 DNA 的变性和复性特点是本技术的基础。经加热，或在强酸、强碱作用下，双链 DNA 氢键被破坏，双股链分离，变成单链（此即变性）；而当条件缓慢变为中性或温度下降（50oC 左右）时，氢键恢复，分开的两股单链又重新合为互补的双链结构（此即复性）。DNA 探针分子杂交就是将样本 DNA 分子经上述条件处理后，使其变性为单链状态，固定在载体硝酸纤维膜上，再与经小分子标记的 DNA 探针单链分子混合，在一定条件下使它们互补杂交结合。将未杂交的成分洗脱后，标记物显色，即可观察结果。选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。 目前，DNA 探针已用于疟原虫、隐孢子虫、贾第虫、锥虫、巴贝斯虫、弓形虫、丝虫、血吸虫、棘球蚴、猪带绦虫、肝片吸虫和猪囊虫等虫种的鉴定和相应疾病的诊断上。 3）常用核酸分子杂交技术：①Southern 印迹杂交；②Northern 印迹杂交；③ 斑点杂交( dotblotting)；④ 原位杂交(in situ hybridization)；⑤ 夹心杂交(三明治杂交)；⑥ 液相杂交。 2. 聚合酶链反应(即 polymerase chain reaction，PCR) PCR 是在引物介导下特异性扩增 DNA 的技术。它包括模板 DNA 热变性解链?引物与模板 DNA 退火?引物延伸 3 个步骤的循环过程。其基本原理是在实验条件下，根据温度的变化控制 DNA 解链和退火（引物与模板 DNA 结合），在引物启动和 DNA 聚合酶催化下，合成二引物特定区域内的 DNA 链。上述“解链?退火?延伸”3 个连续步骤为一个循环。经过 20 ～ 30 个循环反应，可使引物特定区段的 DNA 量增加至少 105 倍。
- 原理： PCR 是模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP )在 DNA 聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的 DNA。包括三个基本步骤：双链 DNA 模板加热变性成单链(变性)；在低温下引物与单链 DNA 互补配对(退火)；在适宜温度下 TapDNA 聚合酶催化引物沿着模板 DNA 延伸。
- PCR 引物： PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性，引物设计决定 PCR 反应的成败。由于致病基因是在正常基因序列中发生点突变、片段插人和(或)缺失，基因两翼的 DNA 序列和正常基因仍然相同，因此根据基因两翼的 DNA 序列可设计出各 20 个碱基左右的一对引物。 3）常用 PCR 技术： 利用 PCR 技术，在适当条件下扩增目的基因，然后分析 PCR 产物，便可判断其是否为致病基因及其变异性质。此外，PCR 具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、样品处理简单等优点。反应过程可在 PCR 仪内自动进行，根据需要目前已衍行和发展出以下方法：① 常规 PCR；② 复合 PCR；③ 反转录 PCR (RT-PCR)；④ 原位 PCR；⑤ 反向 PCR；⑥ 膜结合 PCR；⑦ 彩色 PCR；⑧ 定量 PCR；⑨ 固着 PCR；⑩ 免疫 PCR。 目前，PCR 技术多用于寄生虫病的基因诊断，分子流行病学研究和种株鉴定、分析等领域。已应用的虫种包括利什曼原虫、疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、阿米巴、巴贝氏虫、旋毛虫、锥虫、隐孢子虫、贾第虫、猪带绦虫和丝虫等。 3. 生物芯片技术 生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主要目标是用于 DNA 序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为 DNA 芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。 基因芯片技术（gene chip）它将集成电路、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、荧光标记探针等技术结合为一体，使众多的寡核苷酸探针有规律地排列在硅片上（探针密度可达 105/cm2），用其可与带有荧光标记的 DNA 样品杂交，再通过计算机分析荧光信号获得待测 DNA 样品的序列信息。基因芯片技术大大提高了基因探针的检测效率。在寄生虫学领域，本技术还处于研究之中，目前线虫基因组芯片业已问世。 N 八芯片技术的基本原理是将 cDNA 或寡核苷酸探针以 105 ~ 106 位点／c 耐的密度结合在固相支持物(即芯片)上，每个位点上的 cDNA 或寡核苷酸探针的顺序是已知的，将该探针与荧光标记的待测样品 DNA、RNA 或 cDNA 在芯片上进行杂交，然后用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对杂交信号做出比较和检测，从而迅速得出所需的信息。由于它携带信息量大、体积小、分析过程自动化、分析过程快及所需样品和试剂量少，因而具有广泛的应用前景、迄今能在临床上用于疾病诊断的芯片主要见于传染性疾病，如丙型肝炎、乙型肝炎及艾滋病等少数几种疾病病毒检测芯片。如果将该技术广泛用于疾病诊断，目前仍存在较大困难。原因在于当前对基因功能的认识仍不充分，而且疾病的发生与很多因素有关，要从大量基因库中筛选出疾病相关的特异性基因制成芯片，难度相当大。 （2）肿瘤标志物检测 肿瘤标志物是指肿瘤细胞和组织由于相关基因或异常结构的相关基因的表达所产生的蛋白质和生物活性物质，在正常组织中不产生或产量甚微，而在肿瘤病人组织、体液和排泄物中可检测到。此外，在病人机体中，由于肿瘤组织浸润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低，但与肿瘤发生和发展有关，也可用于肿瘤辅助诊断。 1. 肿瘤标志物的测定方法
- 生物化学技术：用于测定由肿瘤细胞产生并分泌到体液中的肿瘤标志物，因其含量与肿瘤活动度有关，所以适用于绝大多数肿瘤病人的监测、疗效和预后观察。
- 免疫组化技术：可从形态学上详细了解细胞分化、增殖和功能变化的情况，有助于确定肿瘤组织类型、预后和临床特征的分析。
- 单克隆抗体技术：临床上已用于甲胎蛋白(AFP )、癌胚抗原(CEA),前列腺特异性抗原。
- 肿瘤标志物分类
- 原位性肿瘤相关物质：在同类正常细胞含量甚微，而当细胞癌变时迅速增加，如各种癌细胞内的酶气。
- 异位性肿瘤相关物质：是由恶变的肿瘤细胞产生，不是同类正常细胞的组分，如异位性激素、在肺癌时促肾上腺皮质激素(ACTH)明显升高。
- 胎盘和胎儿性肿瘤相关物质：癌细胞的特点是无限增殖，并向周围组织侵袭和转移，甚至向远隔组织转移，而胎盘绒毛细胞和胎儿组织细胞也有这样的特点。当胎儿成长后，有一些物质就消失，如果成人组织细胞发生癌变，这类胎盘性或胚胎性物质就会产生或表达癌胚性物质，如 AFP、CEA；癌胎盘性物质，如 hCG(人绒毛膜促性腺激素)等。
- 病毒性肿瘤相关物质：凡能在人或动物引起肿瘤或细胞恶性转化的病毒，均称为肿瘤病毒。与肿瘤有关的病毒有 HTL-1 病毒(成人 T 细胞白血病)、EB 病毒(Burkitt 淋巴肉瘤)、HS 病毒(宫颈癌与皮肤癌)、HB 病毒(肝癌)和人巨细胞病毒等。
- 癌基因、抑癌基因及其产物：各种致癌因素诱发基因激活和抑癌基因失活及其表达产物异常，是肿瘤发生、发展的重要标志。 需要指出的是，同一肿瘤可含有多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型除有共同的标志物外，也可有不同的特异性标志物，即某一肿瘤的标志物对另一肿瘤来说不一定是标志物，而某一组织的正常产物对另一组织来源的肿瘤却可成为较好的肿瘤标志物。 检测肿瘤标志物的临床意义在于：早期发现或诊断原发肿瘤；筛查肿瘤高危人群；鉴别肿瘤的良、恶性；判断肿瘤的发展过程；观察肿瘤的治疗效果；预测肿瘤的复发和预后。