DNA 原位核酸杂交方法
(一)地高辛(Dig)标记 DNA 探针在石蜡切片上的检测方法? 1?组织切片的预处理? (1)固定：组织以 10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚 4-6 μm，最好用硅化玻， 60℃ 烤片 6-8 h。? (2)脱蜡至酒精。 (3)入 0.2 mmol/L HCl 20 min 去除蛋白。? (4)50℃ 2×SSC,含 5 mmol/L EDTA 溶液中 30 min。? (5)蛋白酶 K(1 μg/ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中)，37℃ 20-25 min。? (6)0.2 mol/L 甘氨酸液：室温 10 min,中止蛋白酶反应。? (7)4%多聚甲醛(PBS 新鲜配制),室温 20 min。? (8)PBS/5 mmol/L MgCl2 漂洗 10 min×2。? (9)脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇，空气中干燥。? 2?预杂交? 加预杂交液 20 μl/每张切片，42℃ 水浴半小时(封闭非特异性杂交位点)。? 3?杂交? 加杂交液 20 μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于 95℃ 10 min，使探针变性，DNA 双链解成单链，然后迅速置于冰上 1 min，再将切片置于盛有 2×SSC 湿盒内，37-42℃ 过夜(16-18 h)。有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交。 4?杂交后漂洗? (1)2×SSC 液内振动移除盖片。? (2)2×SSC 55℃ 5min×2。? (3)0.5×SSC 50℃ 5min×2。? (4)缓冲液 Ⅱ(含 0.5%封阻试剂，用缓冲液 Ⅰ 溶解)37℃ 30 min。? (5)缓冲液 Ⅰ(100 mmol/L Tris-HCl,15.0 mmol/L NaCl pH7.5)15 min,室温。? (6)酶标地高辛抗体(1∶5 000，用缓冲液 Ⅰ 稀释)37℃ 30 min。? (7)缓冲液 Ⅰ 15 min×2，室温。? (8)缓冲液 Ⅲ(100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2 , pH9.5)室温，2 min。?
- NBT/BCIP 显色，显微镜下进行观察。水洗，核固红复染，脱水封片。? 6?结果? 杂交阳性信号呈紫兰色，细胞核呈红。?
(二)生物素标记 DNA 探针在石蜡切片上的检测方法。? (1)固定：组织以 10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚 4-6 μm，最好用硅化玻， 60℃ 烤片 6-8 h。? (2)脱蜡至酒精，空气中干燥。 (3)蛋白酶 K(1 μg/ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中)，37℃ 20-25 min。? (4)PBS 漂洗 5 min×2。? (9)脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇，空气中干燥。? 4?杂交反应? (1)变性和杂交? 加杂交液 20 μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于 95℃ 10 min，使探针变性，DNA 双链解成单链，然后迅速置于冰上 1 min，再将切片置于盛有 2×SSC 湿盒内，37-42℃ 过夜(16-18 h)。有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交。 (2)杂交后漂洗?
- 将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用 2×SSC 将盖玻片洗脱
- 用 2×SSC 30℃ 洗 2 次,每次 5 min
- 用 1×SSC 42℃ 洗 2 次,每次 5 min
- TBS 缓冲液洗 2 次。 注意在漂洗过程中切片不能干燥。? (3)杂交信号的检测? 与免疫组化方法类似,现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测。
- 在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素溶液,室温孵育 20-40 min
- TBS 缓冲液洗 3 次 ×5 min
- 滴加 BCIP/NBT，室温暗处显色 10-30 min,TBS 缓冲液洗
- 0.1%核固红复染 1 min,蒸馏水冲洗
- 酒精脱水,中性树胶封片。? (4)杂交结果? DNA 原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位,一般在细胞核内,呈紫蓝色颗粒状,阴性细胞核呈红色。?