RNA 原位核酸杂交方法

一、基本原理 是指运用寡核苷酸等探针检测细胞和组织的 RNA 表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知 RNA 核苷酸片段，近核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的 Mrna、rRNA 和 tRNA 分子。 RNA 原位杂交不同于 DNA 原位杂交主要有：

1. 使用的探针不同：RNA 原位杂交中多采用 RNA 或寡核苷酸探针，特异性更强。
2. 检测的目的不同：RNA 原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。DNA 原位杂交主要为外源性基因检测。
3. 有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA 原位杂交能获得较好定位。

二、RNA 原位杂交中的探针 探针的种类 RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或 cRNA 分子。根据在 RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性 cDNA、cRNA 探针和人工合成寡核苷酸探针。 探针的标记 根据标记物可分为同位素标记和非同位素标记。非同位素标记技术目前有生物素，地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素。

三、地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的 RNA 原位杂交 （一）组织的前处理

1. 冰冻切片的制备：离体后组织立即取材，1.5cm×1.2cm×0.2cm，放入 4%多聚甲醛溶液中（PBS 新配制），4℃，固定 2-4h。倒去固定液后，加入 30%蔗糖溶液（PBS 新配制），4℃ 过夜，次日将组织切片，或储存在-80℃ 或-140℃ 超低温冰箱内。
2. 组织的固定和石蜡切片的制备：离体后组织立即取材，1.5cm×1.2cm×0.2cm，放入 4%多聚甲醛溶液内（PBS 新配制），也可用 2.5%戊二醛，在室温下固定 3-4h。用 PBS 冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片 （二）操作步骤    1） 二甲苯于 37℃ 脱蜡 2 次，每次 5 分钟；     2） 无水乙醇浸泡 2 次，每次 1 分钟；     3） 95%乙醇浸泡 2 次，每次 1 分钟；     4） PBS 清洗 3 分钟；     5） 2%焦碳酸二乙酯（DEPC）室温下浸泡 10 分钟；     6） PBS 清洗 10 分钟；     7） 滴加不含 RNA 酶的 1ug/ml 蛋白酶 K，37℃ 孵育 15-20 分钟；     8） PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；     9） 0.2N 的 HCl 30 分钟；     10）PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；     11）酸酐处理液振荡洗 2X5 分钟；     12）PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；     13）预杂交缓冲液漂洗 30 分钟；     14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃ 加热 5 分钟， 置于冰块中 10 分钟；     15）杂交 37-42℃ 过夜。     16）将玻片置于 SSC 中 2 次，每次 5 分钟以去除封片；     17）PBS 清洗 3 分钟；     18）含 RNA 酶 A 的 NTE 缓冲液 37℃ 漂洗 30 分钟；     19）PBS 清洗 5 分钟；     20）室温，2×SSC 漂洗 10 分钟；     21）37℃，1×SSC 漂洗 10 分钟；     22）37℃，0.5×SSC 漂洗 10 分钟；     23）37℃，Buffer A 漂洗 10 分钟；     24）加入抗地高辛抗体 37℃ 孵育 3 小时；     25）Buffer A 漂洗 2 次，每次 10 分钟；     26）Buffer B 漂洗 2 次，每次 5 分钟；  27）NBT/BCIP 显色，显微镜下进行观察。  28）水洗；      29）核固红复染，脱水封片。

试剂配制：

1. 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，ddH20 定容 0.5L
2. 0.1mol/L 三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，ddH20 定容 0.4L。
3. 酸酐处理液: 0.25%醋酸酐（临用前用 0.1mol/L 三乙醇胺(pH8.0)配）。
4. 20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，ddH20 定容 1L。
5. 100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，ddH20 定容 50ml。
6. 杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。
7. Buffer A（pH7.5）：100mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L NaCl
8. Buffer B （pH9.5）：100mmol/L Tris-HCl， 100mmol/L NaCl， 50mmol/L MgCl2。
9. Buffer C（pH8.0）：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。
10. NTE 缓冲液：500mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0

11. 预杂交缓冲液：含 50%去离子甲酰胺的 4×SSC

12. NBT/BCIP 液：（NBT：氯化氮四唑蓝，BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐） A、将 10mgNBT 溶于 200ml 二甲基甲酰胺中。 B、于 37℃ 加入 1ml 底物缓冲液（50mmol/L Tris HCl PH=9.5，100mmol/L NaCl 1mmol/L MgCl2 后，滴入）。 C、将 5mgBCIP 溶于 200ml 二甲基甲酰胺中，然后慢慢加入上述溶液中，置-20℃ 保存。