HER2 显色原位杂交法

HER2 显色原位杂交法 一、预处理

1. 脱蜡至水    二甲苯     5 分钟，2 次    100%酒精 1 分钟，2 次    95%酒精   1 分钟，1 次    85%酒精   1 分钟，1 次    双蒸水     1 分钟 ，3 次
2. 加热预处理    热预处理液（试剂盒内带）加热至 98-100℃ 时，放入切片，15-20 分钟。    双蒸水洗     1 分钟，3 次
3. 胃蛋白酶消化    将胃蛋白酶先放入 37℃ 温箱预热，然后滴加至组织上。 室温， 5-30 分钟   （其间用显微镜观察，如果出现细胞核向外突出，有荷包蛋样改变即可停止，此步较为关键，消化不足和消化过了，都会导致假阴性或只有少量阳性）      双蒸水 1 分钟，3 次
4. 酒精脱水    85%酒精 1 分钟，2 次    95%酒精 1 分钟，1 次    100%酒精 1 分钟，1 次 室温或 37℃ 温箱干燥 5 分钟 四、变性和杂交
5. 滴加探针：在组织中央滴加探针（约法 10-15μl），将盖玻片轻轻的盖在组织上，避免产生气泡。
6. 将玻片放在原位杂交仪或原位 PCR 仪上，如没有也可平放于铝制饭盒等底平的器皿底部。
7. 95℃ 变性 5 分钟，如没有原位杂交仪或原位 PCR 仪，可将水烧开，拔去插座，放入铝盒，将水温控制在 95℃-98℃，6 分钟；也可以放入 95℃ 烤箱内，5 分钟。
8. 快速冷却至 37℃（如没有原位杂交仪或原位 PCR 仪，可将铝盒移至冰水中冷却），并将玻片移至湿盒内，37℃ 温箱孵育 12 小时。
9. 杂交后，小心除去玻片，放入 CAS-BlockTM 阻断液或 TBS/Tween20（0.025%）液内洗 1 分钟，然后放入 75℃ 的 CAS-BlockTM 阻断液洗 5 分钟，TBS/Tween20（0.025%）液洗也可达到同样的效果。
10. 双蒸水 1 分钟，3 次 五、免疫显色    1. 滴加 3%甲醇双氧水液 5-10 分钟（室温）。    2. TBS/Tween20（0.025%）液 1 分钟， 3 次。    3. 滴加封闭液 5-10 分钟（室温）。    4. 擦去多余封闭液，滴加小鼠抗地高辛抗体室温 30 分钟。    5. TBS/Tween20（0.025%）液 1 分钟， 3 次。    6. 滴加 HRP-抗鼠抗体室温 30 分钟。    7. TBS/Tween20（0.025%）液 1 分钟， 3 次。    8. DAB 显色 5-30 分钟（镜下控制，以组织芯片同时达到预期强度为标准）。    9. 自来水洗。 六、衬染和封片    1. 苏木素浅染 10-30 秒    2. 水洗，蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。