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免疫组织化学染色方法（间接法）

一、ABC 法（SP、LSAB、SABC 法步骤相同）

ABC(avidin-biotin comeplex)卵白素-生物素复合物法属于亲和免疫组织化学技术，根据卵白素-生物素高亲和力的生物学特性，用生物素与过氧化物酶结合获得生物素过氧化物酶，再加入卵白素和生物素形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。而 LSAB、S-P、SABC 是以抗生物素蛋白链酶素代替卵白素，用标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链酶素（SA）代替 ABC 复合物，步骤相同，但由于 SA 分子量较小，穿透性较好，反应速度较快。并且 SA 有两个和生物素亲和力极高的结合点，其本身没有连接生物素，可以与二抗上的生物素连结，比 ABC 更容易与二抗上的生物素结合，故敏感性高，复合物也不需要使用前混合，更为简单方便。ABC 为三步法，第二抗体为生物素化的 IgG（或 IgM、IgA 等），其中的 Fab 片段与第一抗体结合，这就要求与第一抗体相配对，如第一抗体是鼠抗，第二抗体应该为抗鼠的（或 IgM、IgA 等）；如第二抗体是兔抗，第二抗体应该为抗兔的（或 IgM、IgA 等），还有羊、大鼠、马等来源的抗体。如果使用了鼠兔通用型二抗，那当一抗是鼠或兔时就不必再分了。由于卵白素和生物素亲和力强，故 ABC 较 PAP 敏感 20-40 倍。最后通过复合物上的过氧化物酶与显色反应形成有颜色的沉淀物，可用显微镜观察。过氧化物酶最好的显色剂为 DAB，形成不溶于水的棕色颗粒，可用酒精脱水、二甲苯透明；如用 AEC 显色，生成溶于水的红色沉淀，故不能脱水，只能用水溶性封片剂封固，不利于长期保存。

步骤：

  1. 切片脱蜡至水
  2. 阻断内源性过氧化物酶(198 毫升甲醇或水+2 毫升 30% H2O2)室    温 20 分钟。水洗。
  3. 抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化 37 ℃，30 分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复 20 分钟、或电炉加热 30 分钟、或高压锅加帽出气后 3 分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）
  4. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  5. 滴加正常血清 37 ℃，30 分钟。
  6. 甩去多余血清，加一抗 37 ℃，30 分钟。，
  7. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  8. 滴加二抗，37 ℃，30 分钟。
  9. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  10. 滴加 ABC 复合物，37 ℃，45 分钟。
  11. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  12. DAB 显色 3 ～ 10 分钟。
  13. 水洗。
  14. 苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

二、PAP 法

步骤：

  1. 切片脱蜡至水
  2. 阻断内源性过氧化物酶(198 毫升甲醇或水+2 毫升 30% H2O2)室    温 20 分钟。水洗。
  3. 抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化 37 ℃，30 分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复 20 分钟、或电炉加热 30 分钟、或高压锅加帽出气后 3 分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）
  4. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  5. 滴加正常血清 37 ℃，30 分钟。
  6. 甩去多余血清，滴加特异性抗体 37℃30?60 分钟或 4℃ 过夜，置湿盒中。
  7. PBS 洗。
  8. 滴加二抗，37 ℃，30 分钟。
  9. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  10. 加 PAP 抗体 37℃ 30 分钟。
  11. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，DAB 显色 3 ～ 10 分钟。
  12. 水洗。
  13. 苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

三、APAAP 法

APAAP：属于非标记抗体法，通过具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体，并在抗酶抗体中加入大量的碱性磷酸酶，使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上，形成可溶性的 APAAP 复合物，常用的显色剂为 BCIP/NBT、固红或固蓝。特点不会与内源性过氧化物酶反应，所以背景较为干净，特别适合内源性过氧化物酶较多的组织，如肝、肾。

步骤：

  1. 切片脱蜡至水（冰冻切片或细胞涂片用 PBS 浸泡 3 分钟，不需抗原修复）
  2. 阻断内源性过氧化物酶(198 毫升甲醇或水+2 毫升 30% H2O2)室    温 20 分钟。水洗。
  3. 抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化 37 ℃，30 分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复 20 分钟、或电炉加热 30 分钟、或高压锅加帽出气后 3 分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）
  4. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  5. 滴加正常血清 37 ℃，30 分钟。
  6. 甩去多余血清，适当稀释的特异性抗体，37℃ 60 分钟，或 4℃ 过夜。
  7. TBS 或 PBS（pH7.2）洗 3 次。
  8. 桥抗体，37℃ 40 分钟或室温 1 小时。  9. TBS 或 PBS（pH7.2）洗 3 次。
  9. 滴加适当稀释的 APAAP 复合物，37℃30 分钟。   11. TBS 或 PBS（pH7.2）洗 3 次。   12. 滴加 AKP 底物溶液，37℃ 15??30 分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。   13. 复染（核固红或苏木素或甲基绿）1?2 分钟，常规冲洗后，甘油明胶封片。

四、 LDP（labelled dextran polymer）法（Envision 二步法）

酶标聚合物法，应用了酶标聚合物技术，如 EnVison 检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在葡萄糖聚合物上，再与二抗连接，形成 EnVison 二抗；象 PowerVision 检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在氨基酸片段上。由于聚合物上超过 20 个以上的位点能与一抗结合，聚合物上的酶数量也较多，故较 ABC、LSAB 等方法更为敏感。最为重要的是，由于 LDP 系统二抗上没有生物素的存在，不会出现 ABC、S-P 等方法中出现的与内源性生物素结合的交叉反应，减少了非特异性着色，背景更为干净。

**步骤： **1. 切片脱蜡至水 $1. 0.3％H2O2 甲醇液：阻断内源性过氧化物酶(198 毫升甲醇或水+2 毫升 30% H2O2)室温 20 分钟。自来水洗。

  1. 抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化 37 ℃，30 分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复 20 分钟、或电炉加热 30 分钟、或高压锅加帽出气后 3 分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）
  2. pH7.2 PBS 缓冲液洗三次。
  3. 滴加正常血清 37 ℃，20 分钟。
  4. 甩去多余血清，加一抗，37 ℃，30 分钟。
  5. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  6. 滴加 Envision 二抗，37 ℃，30 分钟。
  7. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  8. DAB 显色 3 ～ 10 分钟。
  9. 水洗。
  10. 苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。

五、双重染色法

  1. 切片脱蜡至水
  2. 阻断内源性过氧化物酶(198 毫升甲醇或水+2 毫升 30% H2O2)室温 20 分钟。 水洗。
  3. 抗原修复：（1）pH7.2 TBS 缓冲液洗三次，胰蛋白酶消化 37 ℃，30 分钟。或（2）按说明书要求：蒸馏水洗，放入抗原修复液（Ph6.0）内微波修复 20 分钟、或电炉加热 30 分钟、或高压锅加帽出气后 3 分钟，快速冷却；或(3) 按说明书要求：不处理）
  4. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  5. 滴加正常血清 37 ℃，30 分钟。（可不用）
  6. 甩去多余血清，加一抗 37 ℃，30 分钟。
  7. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  8. 滴加生物素化二抗，37 ℃，30 分钟。
  9. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  10. 滴加 ABC 或 S-P 复合物（辣根过氧化物酶），37 ℃，45 分钟。
  11. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  12. DAB（棕色）或 AEC（红色）显色 3 ～ 10 分钟。
  13. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  14. 滴加正常血清 37 ℃，30 分钟。（可不用）
  15. 甩去多余血清，加第二种一抗 37 ℃，30 分钟。
  16. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  17. 滴加生物素化二抗，37 ℃，30 分钟。
  18. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  19. 滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30 分钟。
  20. pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
  21. BCIP/NBT 显色（蓝色）
  22. 水洗
  23. 甲基绿复染，脱水，透明，封固。    如果选择辣根过氧化物酶可选择 DAB（棕色）显色，在第 21 步用辣根过氧化物酶复合物，第 23 步用 AEC（红色）显色，但要注意的是 AEC 不能长期保存。如选择另一个为碱性磷酸酶可选用 BCI/NBT、AP-Red、AP-Orange，用 BCI/NBT 显色最好。

六、免疫金法（IGS） 　 1. 切片常规脱蜡入水。

  1. 用 0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30 分钟。
  2. 双蒸水洗 2 次。
  3. 0.05 mol/L TBS PH7.4 洗 10 分钟。
  4. 1％卵蛋白封闭 10 分钟。
  5. 滴加特异性一抗，室温 2 小时或 4℃ 过夜。
  6. 0.5 mol/L TBS PH7.4 洗 3 次。
  7. 1％ 卵蛋白封闭 10 分钟。
  8. 稀释金标抗体 37℃ 45 分钟。。
  9. 0.05 mol/L TBS PH7.4 洗 3 次。
  10. 双蒸水洗 2 次。
  11. 1％戌二醛 10 分钟。
  12. 双蒸水洗 3 次。
  13. 复染、甘油封片、观察。 　   结果：胶体金结合部位呈红色。

七、免疫金银法（IGSS）

  1. 切片常规脱蜡入水。
  2. 经含汞固定液固定的组织切片需经 0.5％碘酒精脱汞,然后入 0.5％硫代硫酸纳水溶液脱碘,流水冲洗,双蒸水洗干净， 0.05 mol/L TBS PH7.4 液洗。
  3. 用 0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 10-30 分钟。
  4. 0.05 mol/L TBS PH7.4 液洗。
  5. 1％ 卵蛋白封闭 10 分钟。
  6. 滴加适当稀释的特异性抗体 37℃ 1-2 小时或 4℃ 过夜。
  7. 0.05mol/L TBS PH7.4 液洗 3 次。
  8. 1％ 卵蛋白封闭 10 分钟。
  9. 滴加适当稀释的金标记抗体室温下 37℃45 分钟。
  10. 0.05 mol/L TBS PH7.2 液洗 3 次。
  11. 蒸馏水洗 2 次，双蒸水洗 2 次。
  12. 入银显影液中 3?5 分钟,反应过程需避光。
  13. 蒸馏水洗。
  14. 自来水冲洗，苏木素淡复染。
  15. 脱水、透明、封片、观察。 结果：特异性抗体结合部位呈灰黑色颗粒，背景呈清灰色，核呈淡蓝色。 试剂配制： 银显影液：
  16. 硝酸银显影液： （1）10%阿拉伯胶水溶液 60ml，柠檬酸缓冲液 pH3.510ml （2）对苯二酚 1.7g 加双蒸水 30ml。 （3）硝酸银 40mg 加双蒸水 2ml。 （1）和（2）两液完全溶解混合，临用前加（3），暗处显影。
  17. 0.05 mol/L TBS (pH7.4)： 　 Tris  12.1g, 　 NaCl  17.5g, 双蒸水 1900ml,充分搅拌溶解,用浓 HCl 调 pH 为 7.4,再加双蒸水至 2000ml

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