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抗原修复

由于甲醛使蛋白质发生交联，在氨基酸分子间形成亚甲基桥从而造成大部分抗原结合位点（抗原决定族）封闭。1991 年 Shi 发现在酸碱溶液中煮沸组织切片能够改变甲醛的固定效应，使交联打开，称为抗原修复技术，从而摆脱了大批抗体只适用于冰冻切片的局限，使免疫组化进入了广泛使用的进程。各种研究证明：对于绝大多数抗体，抗原修复技术优于酶消化法，抗原修复技术的效果取决于加热的温度、时间和抗原修复液的酸碱度。

**一、**微波法：

微波抗原修复法是最早采用的热抗原修复技术方法。

  1. 将脱蜡至水后的组织切片置入盛有抗原修复液的容器中。
  1. 将容器置入微波炉内高档加热至修复液沸腾。
  1. 将微波炉调至低档维持加热 10 分钟。
  1. 将容器连同修复液和切片移出微波炉降至室温。
  1. 拿出切片，PBS 洗 3 分钟进行免疫组织化学染色。

微波修复方法虽然能够达到抗原修复的目的，但是由于微波炉的型号不同、功率不同、室温不一样、切片数量不一样、液体量不一样，所需时间也有所差异，受环境条件影响较大，因此在使用中应根据自己具体的情况摸索使用经验，掌握规律。微波抗原修复的另一个问题是，在同时修复的组织切片中以及在同一切片的不同部位可能会出现修复效果不均匀的现象。在使用同一种抗原修复液的情况下，效果要比高压法略差，比较适合于高 pH 值的抗原修复液（EDTA、EGTA）修复。

二、高压法:

高压抗原修复方法是利用高压锅进行抗原热修复的技术。具体方法是：

  1. 将盛有抗原修复液的高压锅在电磁炉上加热至沸腾。
  1. 将脱蜡至蒸馏水的切片置入抗原修复液中加盖进行热处理，当高压锅气阀喷气后计时 1.5-3 分钟（喷气时间的差异主要是因为后面冷却的方法不同：喷气时间 1.5-2 分钟，采用自然冷却法，切片还浸在高温的液体内 20 多分钟，抗原在高温下继续修复，因此，可缩短喷气的时间；而快速冷却，抗原修复立即被中止，因此，喷气时间一般为 3 分钟）。
  1. 自然冷却 20 分钟至缓冲液 37℃ 以下时拿出切片（超过这个温度拿出，会导致切片由于高温干燥，造成阴阳脸）；或将高压锅置入冷水中降温，待高压锅放气后，打开锅盖，将自来水直接冲入锅内，使缓冲液温度降至 45℃ 以下后，取出切片。
  1. PBS 洗 3 分钟进行后进行免疫组织化学染色。

高压抗原修复方法的优点是暴露抗原决定簇的效果较好，结果稳定，受环境条件影响小（特别适合于高原地区），可重复性高，是一个理想的修复方法；但对于组织处理不佳的切片，容易脱片；同时用高 pH 值的抗原修复液会引起细胞核的碎裂和非特异性的增加，因此，高压修复尽量避免使用高 pH 值的抗原修复液（EDTA、EGTA），建议采用 pH6.0 的柠檬酸抗原修复液。

三、水煮法：

  1. 将抗原修液放入不锈钢杯或烧杯中加热至煮沸（100℃）。
  1. 将脱蜡至蒸馏水的切片置入抗原修复液中继续煮沸 20-30 分钟。
  1. 快速冷却或自然冷却 20 分钟（这二种冷却方法是有差异的。快速冷却，作用立即被中止，而自然冷却，抗原修复作用还在继续，二种方法的阳性强度和背景会存在差异。因此，必须根据实际的抗原修复程度，调整抗体的浓度）。待缓冲液温度降至 45℃ 以下后，取出切片。
  1. PBS 洗 3 分钟进行后进行免疫组织化学染色。

水煮法抗原修复比较稳定，在使用柠檬酸 pH6.0 抗原修复液修复时相对高压法要弱，但此方法非常适合于高 pH 值的抗原修复液（EDTA、EGTA）修复，大多数情况下，用高 pH 值抗原修复液水煮的方法其阳性强度和阳性率均超过 pH 6.0 柠檬酸高压抗原修复方法。是值得推荐的方法。

四、水浴法：

  1. 将盛有抗原修液的容器（如烧杯、不锈钢杯）置入水浴设备（如不锈钢锅、水浴锅）中加热至煮沸 100℃。
  1. 将脱蜡至蒸馏水的切片置入抗原修复液中加热处理 20-30 分钟。
  1. 将烧杯连同抗原修复液和被修复的组织切片一起置入冷水中进行隔水降至室温（37℃ 以下）。
  1. PBS 洗 3 分钟进行后续免疫组织化学染色。

水浴抗原修复方法的优点是作用温和不易脱片，还可以节约抗原修复液，被不少实验室所采用，也有的实验室在高压抗原修复中也采用水浴法。在现实工作中，我们发现此法实验结果不稳定，阳性强度、阳性率有很大差异。

  1. 采用水浴法抗原修复，杯中修复液的温度达不到直接煮的温度（一般在 86℃-94℃），因此，用此方法修复容易出现抗原表达弱、阳性率低的结果；这也是采用水浴法抗原修复不容易脱片的原因。
  1. 不用介质的容器（装抗原修复液用），其热传导性是不一样的，因此其阳性结果也有差异。
  1. 加热工具功率越高、热效能越高（如电磁炉），达到最高温度的差距也越大。与杯中修复液的温度达到所需要的温度成反比。

四种不同的抗原修复方法其结果的阳性率和阳性强度都有很大的差异，我们在选择不同方法进行修复时，必须选择合适的抗原修复液：高压修复比较适合用柠檬酸 pH6.0 抗原修复液，而微波、水煮、水浴比较适合用 pH8.0-10.0 的抗原修复液。不同的抗原修复方法、不同的抗原修复液，都必须调整抗体的稀释比与其相适应。同时还要考虑采用什么样的容器（水浴法应该选择不锈钢杯作为盛放切片和修复液的容器）、加热工具、加热功率并对加热时间做出相应的调整，才能获得正确的实验结果。

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