增强免疫组化特异性染色的方法

1. 抗原修复 其作用是利用化学试剂和热的作用暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增大强特异性染色和避免非特异性染色。

1. 、酶修复：常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶等；酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶的活性通过预试验确定，消化的时间还与组织固定的时间有关，一般是陈旧固定组织所需时间长，以 37℃ 为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长会损伤组织，易使切片脱落，应使用切片粘附剂，消化时间尽量缩短。
2. 、热修复： A.真空负压抗原修复法： 把切片放在 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）内，真空负压干燥箱预先调至 95℃，真空负压处理 10 分钟, 待修复液降至室温，PBS 洗次。   B.微波加热抗原修复法：      把切片放在 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）内，用微波炉加热 10-20 分钟(如液体减少,必须补加)，待修复液降至室温后，PBS 洗次。 C.高压抗原修复法： 把切片放在 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）内，放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续 2-3 分钟。待修复液恢复至室温后，PBS 洗次。 D.隔水热抗原修复法： 切片放入 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，加热至沸腾，持续 30 分钟。待抗原修复液恢复至室温后，PBS 洗次。 E.电炉加热抗原修复法： 切片放入 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，于电炉上加热，，加热至沸腾，持续至 20-30 分钟。待抗原修复液降至室温后，PBS 洗次。

2. 合适的抗体稀释度 抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定是缺少抗原，而是由于抗体过量，这种现象类似于凝集的应中前带效应。因此，必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”，检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。

3. 温育时间 大部分抗体温育时间为 30-60 分钟，必要时可 4℃ 过夜。温育的温度常用 37℃，也可在室温中进行。37℃ 可增强抗原抗体反应，适用于多数抗原染色，应注意在温盒中进行，防止切片干燥而导致失败。

4. 多层染色法 对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP 和 ABC 法（三层）、四或五层 PAP 法或 ABC 法，或 PAP 和 ABC 联合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。

5. 其他增敏方法 如微波处理方法，TAS 增敏方法以及免疫 PCR 方法。