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细菌、霉菌和病毒

细菌 Gram 碱性复红结晶紫法 试剂配制： (1)  苯胺油石炭酸复红液： 碱性品红 0.5g，苯胺油 1ml，石炭酸 1g，30%酒精 70ml。碱性品红溶于 70ml 酒精中，隔水加热至 90℃，冷却后加入石炭酸和苯胺油。

  1. 碘液：碘片 1g，碘化钾 2g，蒸馏水 300ml
  2. 结晶紫染液：结晶紫 2g，95%酒精 20ml，草酸胺 1g，蒸馏水 80ml。 结晶紫溶于酒精，，草酸胺溶于蒸馏水。二液混合，此液置冰箱可保存数月。 操作方法：
  3. 组织固定于 10%甲醛液，按常规脱水包埋。
  4. 切片脱蜡至水。
  5. 苯胺油石炭酸复红液 5 分钟。
  6. 自来水冲洗，蒸馏水洗。
  7. 4%甲醛 1 分钟，蒸馏水洗 2 次。
  8. 苦味酸饱和水溶液处理 2 分钟。
  9. 经过 95%酒精速洗后，放入自来水中立即变红色。
  10. 自来水冲洗，蒸馏水洗。
  11. 碘液作用 2 分钟，自来水洗，用滤纸直接吸干。
  12. 二甲苯苯胺油等份混合，进行分化苯。
  13. 二甲苯透明、中性树胶封固。 结果：革兰氏阳性细菌呈蓝色，阴性细菌呈红色，细胞核呈红色。

**抗酸杆菌 **苯酚碱性品红法：    碱性品红酒精液：碱性品红 5 克    无水酒精 100 毫升    5%苯酚水溶液: 苯酚 5 毫升(略加温,使其溶解) 蒸馏水 95 毫升    苯酚碱性品红液: 碱性品红酒精液 1 毫升    5%苯酚水溶液 9 毫升 染色步骤:

  1. 切片二甲苯脱蜡,95%酒精速洗
  2. 蒸馏水洗
  3. 苯酚碱性品红液染 15 ～ 30 分钟
  4. 蒸馏水洗
  5. 2 %硫酸水溶液分化至适当为止
  6. 水洗
  7. 烘干,透明,封固 结果:抗酸杆菌(结核杆菌和麻风杆菌)呈红色。

**真　菌 （一）高碘酸法复红法 **亮绿液：   亮绿 0.2g        蒸馏水 100 ml       冰醋酸 0.2 ml Schiff 试剂配制: 碱性品红 1 g ，活性炭 2 g ，当量盐酸 20 ml ，偏重亚硫酸钠 1.5 g

  1. 碱性品红 1g，放入 200 毫升蒸馏水中，煮沸，搅拌，充分溶解。
  2. 冷却至 50℃ 时过滤，滤液中加入当量盐酸 20 毫升。
  3. 加偏重亚硫酸钠 1.5 g，置于暗处过夜。
  4. 加活性 2 g，摇晃，过滤，以无色为最佳。棕色瓶，4℃ 冰箱保    存。

染色步骤:

  1. 切片脱蜡至蒸馏水。
  2. 0.5%～ 1%过碘酸水溶液 5 ～ 10 分钟。
  3. 蒸馏水洗多次。
  4. Schiff 液 10 ～ 15 分钟。
  5. 0.5%偏重亚硫酸钠液洗 2 次,每次 1 分钟。
  6. 流水冲洗 10 分钟。
  7. 亮绿液复染数秒钟。
  8. 水洗，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。 结果：真菌红色，其他组织绿色。

**（二）六胺银染色法 **六胺银液配制：        3%六次甲基四胺水溶液   5 ml        2.5%硝酸银水溶液       0.5 ml 摇晃，变清，再加 2.5%四硼酸钠 1.5 ～ 2 ml 加蒸馏水至 30 ～ 40 ml 步骤：

  1. 切片脱蜡至水，蒸馏水洗
  2. 0.5%高碘酸浸 15 分钟，蒸馏水洗
  3. 六胺银液 60℃，1 ～ 2 小时，（或六胺银液 80 ～ 90℃，半小时左右，）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）
  4. 0.2% 氯化金调色数秒
  5. 丽春红淡染
  6. 水速洗
  7. 烘干，透明，封片。 结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。

幽门弯曲菌（HP） （一）HP（美蓝法） 美蓝液: 美蓝(亚甲基蓝)1. 0 g ， 硼酸 0 . 5 g ，加蒸馏水至 100 ml   步骤：   1  切片脱蜡至水   2  入美蓝液中 1 分钟   3  水洗后烤箱烘干封固(不宜酒精脱水) 结果:  幽门弯曲菌深蓝色 优点:  试剂配制容易，染色方法简单 应用：帮助慢性胃炎、消化道溃疡的诊断及治疗。

（二）、HP（硝酸银法） 试剂配制： （一）  醋酸缓冲贮备液，PH3.6 0.2N 醋酸缓冲液，PH3.6             10 ml 蒸馏水                             240 ml 以下各液均用此液配制 （二） 1 %硝酸银液 硝酸银                             1 g 醋酸缓冲贮备液，PH3.6             100 ml  （三） 2 %硝酸银液 硝酸银                             0.2 g 醋酸缓冲贮备液，PH3.6              10 ml （四） 5 %明胶液 明胶                              5 g 醋酸缓冲贮备液，PH3.6             100 ml 先把醋酸缓冲贮备液加温至 40℃ 左右，然后倾入明胶，于 37℃ 温箱内慢慢溶解，搅拌。 （五） 3 %对苯二酚液 对苯二酚                          0.3 g 醋酸缓冲贮备液，PH3.6             10 ml （六）  明胶对苯二酚液 3 %对苯二酚液                     1 ml 5 %明胶液                        15 ml （七）  显影液 明胶对苯二酚液                   16 ml 2 %硝酸银液                      3 ml   在操作到第 4 步完成前 5 分钟充分混合，置于 56℃ 水浴箱中保温待用。 操作方法：

  1. 组织脱蜡至蒸馏水
  2. 醋酸缓冲贮备液洗 2 次
  3. 入 1 %硝酸银液中，56℃，1 小时
  4. 切片不水洗，直接放入预热的显影液中 56℃，肉眼呈黄棕色为止。
  5. 倾去显影液，于 56℃ 的水中浸洗 2 分钟
  6. 水洗
  7. 脱水，透明，封固。
  8. 结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。 注意：载玻片不能用粘贴剂或用硅化玻片

新型隐球菌 （一）、爱先蓝法（根据 Steedman，1950；Lison，1954） 试剂配制：

  1. 爱先蓝水溶液（pH2.5）：爱先蓝（alcian blue 8GX）1g，蒸馏水 97ml，冰醋酸 3ml，麝香草酚 50mg（可不加）
  2. 核固红液：核固红（nuckear fast red）0.1g，蒸馏水 100ml，硫酸铝 5g，麝香草酚 50mg（可不加） 先把硫酸铝溶于蒸馏水，然后加入核固红，稍加温溶解，冷却后过滤，最后加入麝香草酚（可不加）。 操作方法：
  3. 组织固定于 10%甲醛液，按常规脱水包埋。
  4. 切片脱蜡至水。
  5. 爱先蓝染液染 10-20 分钟。
  6. 水洗。
  7. 核固红液复染 5-10 分钟。
  8. 水洗。
  9. 常规脱水透明，中性树胶封固。 结果：新型隐球菌的荚膜呈蓝色，胞核红色。

（二）粘液胭脂红法（根据 Southgate 改良 Mayer，1927） 试剂配制： Southgate 粘液胭脂红贮备液：胭脂红（carmine）1g，无水酒精 50ml，蒸馏水 50ml，氢氧化铝，0.5g 用烧杯放入无水酒精和蒸馏水，使其混合成 50%酒精，依次加入胭脂红等，用玻璃棒搅拌混和，于水浴中煮沸 3 分钟，并不断搅动。

待冷至室温后过滤，并用 50%酒精加至 100 毫升。临用前取贮备液 1 份，蒸馏水 4 份混合使用。也可直接用贮备液来染色。 操作方法：

  1. 切片脱蜡至水。
  2. 用苏木素染核。
  3. 自来水洗。
  4. 1%盐酸酒精分化。
  5. 流水冲洗 10 分钟。
  6. Southgate 粘液胭脂红稀释液染 20-30 分钟。
  7. 水洗去多余染液。
  8. 常规脱水透明，中性树胶封固。 结果：新型隐球的荚膜染成红色，胞核蓝色。

乙型肝炎表面抗原（一）地衣红法（根据（Shikata，1974） 试剂配制：

  1. 酸化高锰酸钾水溶液： 甲液：0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾 0.5g，蒸馏水加至 100ml 乙液：0.5%硫酸水溶液：纯硫酸 0.5ml，蒸馏水 99.5ml 甲、乙两液分瓶装，临用前等份混合。
  2. 2%草酸水溶液：草酸 2g，蒸馏水加至 100ml
  3. 酸化地衣红酒精液：地衣红（orcein）1g，70%酒精 100ml，盐酸 1ml 先将浓盐酸倾入 70%酒精中，然后加入地衣红，混合后用玻棒搅动，使其尽量溶解，其 pH 值相当于 1.0，放置 1-2 天后即可使用。 操作方法：
  4. 切片脱蜡至水。
  5. 酸化高锰酸钾水溶液氧化 5 分钟。
  6. 水洗。
  7. 2%草酸液漂白 2-3 分钟，至切片无色为止。
  8. 流水冲洗 2-3 分钟。
  9. 70%酒精稍洗。
  10. 置入酸化地衣红酒精液内染 3-5 小时。
  11. 70%酒精浸洗二次，每次约 10-30 秒钟，至无染液脱出为止。
  12. 常规脱水透明，中性树胶封固。 结果：肝细胞内的乙型肝炎表面抗原染成棕红至深棕色，呈微细颗粒状或无质状。弹性纤维也染为深棕色，其余底色为较浅淡的灰

棕色。肝细胞核不着色。

（二）、醛品红法（根据 Gomori，1950） 试剂配制：

  1. 酸化高锰酸钾水溶液： 甲液：0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾 0.5g，蒸馏水加至 100ml 乙液：0.5%硫酸水溶液：纯硫酸 0.5ml，蒸馏水 99.5ml 甲、乙两液分瓶装，临用前等份混合。
  2. 2%草酸水溶液：草酸 2g，蒸馏水加至 100ml
  3. 醛品红染液：碱性品红 0.5g，70%酒精 95ml，浓盐酸 1ml，三聚乙醛 1ml      将碱性品红溶解于 70%酒精，然后加浓盐酸和三聚乙醛 1ml，慢慢摇动使之均匀混合，24 小时后可以使用。 操作方法：
  4. 切片脱蜡至水。
  5. 酸化高锰酸钾水溶液氧化 5 分钟。
  6. 水洗。
  7. 2%草酸漂 2-3 分钟，至切片无色为止。
  8. 流水冲洗 2-3 分钟。
  9. 70%酒精稍洗。
  10. 置入醛品红液内梁 5-10 分钟。
  11. 70%酒精浸洗二次，每次约 10-30 秒钟。
  12. 、常规脱水透明，中性树胶封固。 结果： 肝细胞的乙型炎表面抗原被染为紫至深紫色，弹力纤维深紫色。

**（三）、维多利亚蓝法 1981. ** 试剂配制：

  1. 维多利亚蓝染液：维多利亚蓝（victoria blue）2g，糊精（dextrin）0.5g，间苯二酚（resorcin）4g，蒸馏水 200ml 取一只 500ml 烧杯，加入蒸馏水，再把维多利亚蓝、糊精和间苯二酚加入溶解，在慢火中煮沸，然后再用另一只烧杯煮沸 30%三氯化

铁液 25 毫升，慢慢倒入维多利亚蓝混合液中，继续煮沸 3 分钟，不断搅拌呈胶体物。冷却后过滤，将沉渣和滤纸放在 60℃ 烧箱内烤干

。取另一只烧杯盛 70%酒精 400 毫升溶解沉渣，然后加入冰醋酸 4 毫升和苯酚 6 克作防腐剂，放置一周成熟后使用。

  1. 酸化高锰酸钾水溶液： 甲液：0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾 0.5g，蒸馏水加至 100ml 乙液：0.5%硫酸水溶液：纯硫酸 0.5ml，蒸馏水 99.5ml 甲、乙两液分瓶装，临用前等份混合。
  2. 2%草酸水溶液：草酸 2g，蒸馏水加至 100ml
  3. 核固红染液：核固红 0.1g，5%硫酸铝水溶液 100ml        将核固红溶于硫酸铝水溶液中，加温煮沸后冷却，过滤备用。 操作方法：
  4. 切片蜡至水。
  5. 酸化高锰酸钾水溶液氧化 5 分钟。
  6. 水洗。
  7. 2%草酸液漂白 2 分钟。
  8. 流水冲洗 5 分钟。
  9. 70%酒精稍洗。
  10. 置入维多利亚蓝液内染 24-48 小时。
  11. 70%酒精浸洗二次，每次约 1-3 分钟，至切片不有染液脱出为止。
  12. 流水稍冲洗。
  13. 核固红液染核 5-10 分钟。
  14. 水洗。
  15. 常规脱水透明，中性树胶封固。 结果：肝细胞内的乙型肝炎表面抗原呈蓝色，弹力纤维和胶原纤维也着染蓝色，胞核红色。

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